Postopek kloniranja s prenosom somatskega jedra in povezava z zanositvijo ter reprodukcijo

Intrauterina inseminacija (IUI) je ena osnovnih metod umetne oploditve. Je prva možnost zdravljenja za pare, ki niso uspeli zanositi z ostalimi načini zdravljenja neplodnosti. To velja predvsem za pare, katerih neuspeh je posledica nekoliko slabše kakovosti partnerjeve sperme ali neredne ovulacije partnerke. Ta program je primeren tudi za bolnike z imunološkim faktorjem neplodnosti. Metoda IUI olajša pot spermijem do jajčne celice. Spermiji se izognejo škodljivim učinkom okolja vagine in materničnega vratu. Skrajšan je čas, potreben za dosego jajčeca.

Postopek IUI: 1. V laboratoriju IVF pri se pri pripravi semenskega izliva partnerja pridobi vzorec z največjim možnim številom kakovostnih semenčic. 2. Ustrezen odmerek semenske tekočine se z dolgim tankim katetrom (premer 1,8 mm) vnese neposredno v maternico ženske. Pred postopkom IUI se mora opraviti test prehodnosti jajcevodov ženske. Običajno se uporablja svež spolni izliv partnerja. Običajno se hkrati izvaja tudi blaga hormonska stimulacija ovulacije partnerice. Cilj stimulacije pred IUI je zorenje 1 do 2 foliklov. Stimulacija poveča možnosti za zanositev. Postopek je popolnoma neboleč. V prvem ciklu zdravljenja IUI zanosi 5 do 10% žensk. Uspeh je odvisen od starosti ženske in se s starostjo zmanjšuje. Po 40. letu se skoraj ne izvaja več.

IVF in ICSI: osnovni okvir

Zunajtelesna oploditev ali in vitro fertilizacija (IVF, ICSI) je metoda simptomatskega zdravljenja, pri katerem se jajčne celice ženske oplodijo s semenčico partnerja zunaj ženskega telesa - oploditev in vitro. IVF/ICSI postopek se začne s hormonsko stimulacijo ženske, ki je potrebna za pridobitev več jajčec kot pri rednem ovulacijskem ciklusu. Potek stimulacije spremlja zdravnik z ultrazvokom. Zrela jajčeca se zbirajo s punkcijo foliklov pod nadzorom ultrazvoka. Na dan odvzema jajčec se odvzame tudi seme partnerja. Dobljena jajčeca se nato oplodijo s semenčeci partnerja, nastali zarodki pa se gojijo zunaj ženskega telesa v inkubatorju. Po nekaj dneh gojenja (največ 6 dni) se najboljši zarodek prenese v maternico ženske - embrio transfer (ET).

Pri IVF-u ločimo dve osnovni metodi. Če se seme zadostne kakovosti, je v uporabi manj invaziven in nekoliko uspešnejši t.i. klasičen IVF. Če je kvaliteta semena slaba, v poštev pride zgolj t.i. intracitoplazemska injekcija spermija ali ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection). Bistvo te metode je, da zdrav spermij vnesemo neposredno v citoplazmo zrele jajčne celice. Oplojena jajčna celice ali zigota je izjemno občutljiva na vsakršna odstopanja od optimalnih pogojev, kakršni so v maternici.

V ta namen so se sočasno z razvojem sodobnih metod asistirane reprodukcije razvila tudi gojišča in inkubatorji za gojenje zgodnjih zarodkov. Celoten razvoj zarodka v laboratorijskem okolju mora posnemati spremembe pogojev pri potovanju oplojene jajčne celice po jajcevodu in maternici. Zarodki se lahko izven telesa razvijajo največ 5-6 dni, to je do levitve. Zarodki se razvijajo v inkubatorju, kjer so podobni pogoji kot v jajcevodu oz. maternici.

Na dan prenosa se ginekolog, embriolog in par pogovorijo na osnovi več kriterijev: število zarodkov, kvaliteta zarodkov, anamnestični podatki, želje para. Navadno v maternico prenesemo 1 ali 2 najboljša zarodka. Odločitev o izbiri je prepuščena embriologu, ki zarodke ocenjuje in spremlja ves čas od punkcije do prenosa v maternico. V izogib subjektivnemu faktorju te izbire so embriologom danes v pomoč t.i. time lapse tehnologija. Gre za inkubatorje z vgrajenimi kamerami, ki nenehno snemajo razvoj zarodka.

Ključni koraki klasičnega IVF

Med punkcijo jajčnikov embriolog zbira folikularno tekočino in v njej identificira jajčne celice. Jajčne celice so izredno občutljive na vsakršne spremembe temperature, zato je vitalnega pomena, da je ta proces čim krajši. Folikularna tekočina se zbira v ogretih epruvetah, ki se zbirajo v prav tako ogretem termo bloku in na ta način zmanjšamo možnost nihanja temperature. Embriolog na ogreti površini v brezprašni komori nato poišče jajčne celice, ki so obdane z granuloznimi celicami. Celice zbere in prestavi v ustrezno gojišče s HEPES pufrom, ki omogoča stabilne pogoje izven inkubatorja.

Klasični IVF je najboljši približek naravni oploditvi jajčne celice v ženskem telesu. Kompleksu jajčne celice z granuloznim ovojem se v petrijevki doda prečiščeno in skoncentrirano seme partnerja ter tako omogoči oploditev sposobnemu spermiju. Naslednji dan embriolog odstrani granulozne celice in preveri, če je prišlo do oploditve. Prav tako izloči vse nepravilno oplojene celice (triploidne in monoploidne), zgodi se namreč, da jajčno celico oplodita dva spermija ali pa pride do nepravilne formacije pronukleusov med procesom združevanja kromosomov. Neposreden vnos spermija v jajčno celico je vsekakor eden od mejnikov v reproduktivni medicini in zdravljenju neplodnosti. Pari, ki so bili prej primorani rešitev poiskati v posvojitvi ali darovanih spolnih celicah, so dobili priložnost, da do otroka pridejo z lastnimi celicami.

Prvi uspešen ICSI je leta 1991 uspel italijanskemu embriologu dr. Palermu na univerzi v Bruslju. Od takrat se je na svetu po tej metodi rodilo že blizu 5.000.000 otrok in danes je ICSI rutinski postopek, ki nam omogoča uspešno zdravljenje tudi zelo težkih oblik moške neplodnosti. Postopek odvzema in zbiranja jajčnih celic se ne razlikuje od klasičnega IVF postopka. Ker pa je ICSI tehnika, ki zahteva manipulacijo jajčnih celic, je potrebno granulozni ovoj pred postopkom odstraniti. S tanko pipeto embriolog neposredno pred vnosom spermija previdno odstrani granulozne celice in tako omogoči pripetje jajčne celice na t.i. držalno pipeto. Uporabimo le jajčne celice, ki so v drugi metafazi mejotične delitve (MII), kar pomeni da so v tem kratkem časovnem oknu sposobne nadaljevanja mejoze in združevanja kromosomov ter tvorjenja zigote. Z drugo vnosno pipeto embriolog poišče morfološko primeren spermij in ga s pomočjo naprave mikromanipulator posesa v pipeto.

Kaj se zgodi 24 ur po oploditvi? Zarodki se prestavijo v svež, predhodno kalibriran medij; Oceni se uspešnost oploditve; Loči se nepravilno oplojene in neoplojene jajčne celice od ostalih. Zarodki se nato razvijajo brez nepotrebnih motenj v inkubatorju do 72 ur po oploditvi, ko se ponovno preveri njihov razvoj. Če smo se odločili za prenos zarodkov na 3. dan, ga opravimo. Če podaljšamo gojenje do 5. dne, se zarodki prestavijo v medij, ki s svojo sestavo omogoča razvoj zarodka do stopnje blastociste. V našem centru uporaba Vitrolife medijev omogoča stabilno in kontrolirano okolje za zarodke. Celotna paleta ostalih medijev je izdelana po najstrožjih merilih kontrole kakovosti in transporta.

Skupno uspešnost postopkov OBMP izboljšajo postopki zamrzovanja in hranjenja zarodkov. Nadštevilčni zarodki dobre kvalitete po ICSI ali IVF postopku se zamrznejo in hranijo v tekočem dušiku daljši čas. V zadnjih letih klasično zamrzovanje izpodriva ultra kratko zamrzovanje ali vitrifikacija, ki je kratek in zelo učinkovit postopek. Zarodki se dehidrirajo z raztopinami, kar prepreči tvorjenje vodnih kristalov ter poškodb zarodka.

Kromosomske in genske napake so pogost vzrok neuspešnega zdravljenja neplodnosti. Napake so lahko dedne ali pa nastajajo med gametogenezo ali po oploditvi. Na srečo so danes v uporabi načini, ki zaznajo nepravilnosti že pred prenosom zarodka v maternico ali celo pred izvajanjem oploditve z biomedicinsko pomočjo. Z biopsijo dela zarodka (blastomere, trofektoderma ali polarnega telesa) se z metodami PCR, FISH ali NGS ugotovi specifične mutacije. Na ta način se v maternico prenesejo zgolj zdravi zarodki. Poudariti je treba, da novejše metode omogočajo tudi neinvazivno testiranje gojiščnih medijev in podaljšano gojenje do stadija blastociste.

Kloniranje: zgodovina, metode in etika

Kloniranje je proces, pri katerem se ustvari genetsko identičen organizem, celica ali molekula z istim dednim materialom. Postopek vključuje somatski celični jedrni prenos (SCNT), kjer se jedro telesne celice prenese v jajčno celico brez jedra. Jajčna celica se spodbuja k delitvi in nastanku zarodka, ki se nato vstavi v nadomestno mater. Prvi klonirani sesalec je ovca Dolly, kar je pomemben mejnik v biomedicini. V različnih vrstah kloniranja so bili uporabljeni različni organizmi, vključno z miši, psom, mačkami in govedom.

Prednosti kloniranja vključujejo potencial za regenerativno medicino, ohranjanje ogroženih vrst in možnost prilagajanja koroniranih lastnosti v kmetijstvu. Slabosti pa so zmanjšana genetska raznolikost, tveganja za poškodbe in številni etični pomisleki. Kloniranje ni le tehnika pridobivanja kopij, temveč kompleksen stereotip etičnih dilem in socialnih vplivov, ki zahtevajo premišljene odločitve.

V kontekstu matičnih celic so omenjene tudi embrionalne matične celice in terapevtsko kloniranje, kjer se zarodke žrtvuje za pridobivanje matičnih celic. Shranjevanje popkovne krvi postaja pomemben vir multipotentnih matičnih celic, kar ima potencial za zdravljenje raka, poškodb in drugih bolezni. Razprave o etičnosti terapevtskega kloniranja in uporabe embrionalnih matičnih celic ostajajo aktualne po svetu.

Praktične povezave med kloniranjem in reprodukcijo človeka

Poznamo primere kloniranja v naravi (enojajčni dvojčki) in v laboratoriju (SCNT). V kontekstu človeka so etične dileme zelo izrazite, zato je tema pogosto obravnavana z vidika regulacije in varovanja človekovih pravic. Tekst opisuje tudi pomisleke glede načina, kako bi jedrni prenos vplival na DNK in dedne lastnosti ter ali bi bile morebitne potomce enakovredne donatorjem.

Prav tako so omenjeni primeri kloniranja živali, ki so pokazali različne uspešnosti glede na vrsto in pogoje. Pomembno je, da razumevanje SCNT zahteva natančen pristop, obravnava tveganja ter etične in pravne vidike, ki so v središču javne razprave o prihodnosti biotehnologije.

Tabela: ključne točke IVF/ICSI in kloniranja

Na koncu je mogoče dodati, da razna raziskovalna področja vključujejo tudi gensko inženirstvo ter uporabo matičnih celic za zdravljenje bolezni. Poudariti je treba, da tehnologije pogosto napredujejo, vendar ostajajo temeljne etične in socialne dileme, ki jih je treba skrbno reševati.

tags: #kloniranje #trenje #jajcec #zanositev